如何选择合适的内参抗体？

 

内参是什么？

内参是指在不同细胞或组织间表达相对稳定，且具有高水平表达量的蛋白，通常在Western Blot实验中比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多寡，因此必须先确定上样量相同，才有比较的基础。在Western Blot实验中，可能因总蛋白浓度测定不准确，或是蛋白质上样时因操作产生误差，所以必须设置内部参照组来进行校正。而这样的参照蛋白，就称为内参，对应的抗体就称为内参抗体。

 

内参在Western Blot中的关键作用

1、用于校正蛋白水平，确保不同样品间蛋白定量（上样量）相同。可从条带粗细初步判定上样量是否有差异；然后，使用影像分析程序将目标蛋白除以内参含量，所得到的数值即为校正后的目标蛋白相对含量，以此进行目标蛋白相对量的比较。

2、确认转膜转膜、显色等步骤是否均匀转移，呈色。内参一般选用高表达的蛋白，因此可通过内参的条带，观察Western Blot实验过程中的转膜、呈色等步骤是否有误。

3、对文章发表绝对重要，增加实验可信度。

 

如何挑选合适的内参抗体？

通常选择在各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参，但不同的实验还是有一些细节要注意，挑选内参可参考下面四点：

 

1、目标蛋白的分子量。

内参蛋白最好与目标蛋白的分子量有5 kDa以上的差异，在Western Blot实验中能做区隔。分子量若太过接近，不利后续条带的分析。例如目的蛋白分子量为34 kDa，则可考虑选择分子量19 kDa的Cofilin 1，不宜选择34 kDa GAPDH作为内参。

 

 

2、研究的领域

挑选的内参是否会受实验变化影响？例如GAPDH是常用的内参，但在代谢糖酵解的研究中，可能就不适合做内参；在凋亡实验时，TBP、Lamin A + C等与凋亡相关的因子也不适合作为内参。内参最好是选择在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白，这也是大家最容易忽略的一点。

 

3、样本来源

a-哺乳动物来源的组织或细胞样本，通常选择β-actin、GAPDH、COX4、Histone H3等。

b-其他来源样本应该参照文献，选择合适的蛋白作为内参，例如植物样本可用bata actin，Ubiquitin，Rubisco作为内参。

 

4、是否使用亚细胞萃取?

一般的蛋白检测常用β-actin、GAPDH抗体等，如针对核蛋白定量，常用的核内参抗体有Lamin B、Histone H3、PCNA。

 

常用内参的分子量和细胞定位：

 

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