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公司新闻/正文
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
2045 人阅读发布时间：2021-12-10 16:32
DC 是 “Dendritic Cells” 的缩写，中文全称为 “树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯，一能够显著刺激初始 T 细胞 (Naïve T cells) 增殖的 APC，而其它种类的 APC (如单核巨噬细胞，B 细胞等) 仅能刺激已活化的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。
虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要，所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核细胞 (PBMC) 诱导 DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨髓来源的 DC (Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
【步骤简图】
本文主要介绍：
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法 (改良) 【BMDC 大量制备法】-Son 法 【BMDC 大量制备法】-Lutz 法 【注意事项】
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法 (改良)
背景：
1. Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106 个 / 小鼠； 2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体 + 补体法预先去除，后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高 BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做 [10]；
3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 1.1 小鼠 (6 - 10 周龄) 颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨 (femurs) 和胫骨 (tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净； 注：不要损伤到骨。 1.2 将骨移至超净台内，并用盛有 70% 酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次； 1.3 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至 骨完全变白； 1.4 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织； 1.5 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 1.6 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液 (1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min；
氯化铵红细胞裂解液的配制： 1. 先配制 10x 的贮存液，配法如下： 称取 82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3 和 0.37g Na2EDTA，溶于 1L 的蒸馏水中，0.22μm 滤膜过滤除菌，4oC 储存 6 个月； 注：可根据需要配制适量的 10x 贮存液，其中各组分需成比例增减。 2. 临用前，将 10x 贮存液用无菌蒸馏水 1 : 9 稀释成 1x 工作液即可。 注：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。 1.7 加入 10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后 1200 rpm 离心 5min，弃上清；1.8 PBS 洗 1 次，然后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。 2. BMDC 的诱导分化
2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 0.5-1 x 106/ml； 2.2 铺至 24 孔培养板内，每孔 1ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (20ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养，此为培养的第 0 天； 注：1) 一般一只小鼠大约可收获 4-5 x 107 个骨髓细胞，所以可以铺至少 40-50 个 24 孔板板孔。 2) GM-CSF 和 IL-4 的使用浓度区间分别为 20-50ng/ml 和 10-40ng/ml。 2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。 2.4 在第 5 天和第 8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞； 2.5 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 2.6 用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至 1 x 106/ml，并加入重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml)； 2.7 细胞铺板至 100 mm 培养皿 (每皿最多 10ml) 或 6 孔培养板 (2m / 孔)。 2.8 37℃，5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天； 2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的 BMDC。
3. BMDC 的完全成熟 注：步骤 2 中获得的 BMDC 并非完全成熟的 DC，若想得到完成成熟的 DC，还需 LPS，CD40L 或 TNF-a 等的诱导。 3.1 步骤 2.4 或 2.9 中获得的 BMDC 以 1200rpm 离心 5min，弃上清； 3.2 用含重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml) 的 RPMI 完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为 1 x 106/ml； 3.3 加入 24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如 TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或 CD40L (1μg/ml) 等； 3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天； 3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。
【BMDC 大量制备法】-Son 法
背景： 1. 该法可在 7 天内获得 30-40 x 106 个 DC / 小鼠，是 Inaba 经典方法的 7-10 倍。DC 经 14.5% 甲泛葡胺 (Metrizamide) 梯度离心后，纯度 (即 CD11c+/I-Ab + 细胞) 可达 85-95%。 2. 该法获得的 DC 的内吞能力弱于 Inaba 经典方法，但分泌的 IL-12p70 量相似； 3. 该法获得的 DC 在混合淋巴细胞反应中比 Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力； 4. 该法获得的 DC 能引起更强的特异性 T 细胞反应； 5. 以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的 BMDC。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法 (改良) 中的相应步骤。 2. BMDC 的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml； 2.2 铺至 6 孔培养板内，每孔 5ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养； 2.3 在培养的第 4 天，向培养体系中补充重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)； 2.4 培养的第 7 天收集 DC，用 2-4ml RPMI 1640 完全培养液重悬，加至等体积的 14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200 x g 室温离心 20min； 注：此时的 DC 为不完全成熟的 BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤 3。 2.5 收集中间层，并用 RPMI 1640 完全培养液洗 3 次备用。 3. BMDC 的完全成熟 3.1 步骤 2.4 中收集的 BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)，以及 LPS (1-10μg/ml) 3.2 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天，获得成熟的 BMDC。
【BMDC 大量制备法】-Lutz 法
背景：
1. Lutz 法与 Son 法相似，均可大量制备 BMDC，但与 Son 法相比，Lutz 法更为广泛地被采用。 2. 该法可获得更多的 BMDC，达 1-3 x 108 个 / 小鼠，而且纯度可达 90-95%； 3. 该法比 Son 法使用的细胞因子浓度低得多，仅为 200U/ml，而且培养的第 8 天到第 10 天降为 30-100U/ml，这样可以大幅节约试剂成本； 4. 该法与 Inaba 经典方法和 Son 法的最大不同是使用细菌培养皿 (Petri dish) 而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对 DC 成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。 5. 但该法的培养时间较长，需要 10-12 天，一方面是为了获得更多的 BMDC，另一方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的 BMDC 的纯度； 6. 该法仅用 GM-CSF 进行诱导培养，得到的 BMDC 中未成熟和成熟 DC 均有，若要进一步提高成熟度，需用 LPS 或 TNF-α 再诱导 1-2 天，其中成熟 DC 细胞的含量将达到 50-70%。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法 (改良) 中的相应步骤，注意省去溶血步骤。
2. BMDC 的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml； 2.2 铺至 100mm 细菌培养皿 (Petri Dish) 中，每皿 10ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (200U/ml，对于 PeproTech 的 GM-CSF，相当于 20ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养； 注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。 2.3 第 3 天时，向培养皿中再加入 10ml 含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液； 2.4 第 6 天和第 8 天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿； 2.5 第 10 天时可收集细胞，即为 BMDC。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 培养第 10 天的 DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300 x g 室温离心 5min；
3.2 弃上清，用 10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀，然后铺于 100 mm 细胞培养板；
3.3 加入重组小鼠 GM-CSF (100U/ml ， 相当于 PeproTech 的 10ng/ml) 和 TNF-α (500U/ml)，或重组小鼠 GM-CSF (100U/ml，相当于 PeproTech 的 10ng/ml) 和 LPS (1μg/ml)； 3.4 37℃，5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天。
【BMDC 的鉴定】
1. 形态学观察：BMDC 多数呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的 BMDC 更加明显； 2. 细胞表型分析：流式细胞术检测 DC 细胞表面 CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 类分子 (I-A/I-E) 等的表达，BMDC 高表达这些分子，完全成熟的 BMDC 中这些分子的表达会进一步提高。 3. 混合淋巴细胞反应 (MLR)：BMDC 具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
【注意事项】
1. 小鼠品系和性别： 多数研究表明，所使用的小鼠品系与获得 BMDC 的数量和成熟度关系不大，但也有研究表明 C57BL/6 小鼠可能更好。 Lutz 表示从 C57BL/10，DBA/2，C3H/J 和 129 等小鼠品系均可获得足够数量和纯度的 BMDC，但 Lutz 在其实验中更倾向于使用 C57BL/6，ICR 和 BALB/c 小鼠，且发现 C57BL/6 小鼠的 BMDC 产量最高，而且 ICR 小鼠和 C57BL/6 小鼠的 BMDC 对 LPS 的成熟诱导敏感度高于 BALB/c 小鼠。 关于小鼠的性别，Inaba 认为雄性小鼠更好些，因为他们的骨骼更大，从而可以获得更多的前体细胞，但多数学者更倾向于使用雌性小鼠。因此，目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。
2. 单独使用 GM-CSF 还是联合使用 IL-4? Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中均仅用 GM-CSF 即可诱导出相当数量的 BMDC，而且也在混合淋巴细胞反应中表现出较强的刺激作用，但其实这些 BMDC 的成熟度并不足够高。 研究显示，GM-CSF+IL-4 联合诱导比 GM-CSF 单独诱导产生的 BMDC 表达更高的 MHC II 类分子和共刺激分子 CD80 和 CD86 等，提示前者具有更强的抗原递呈能力，而且前者在混合淋巴细胞反应中表现出更有效的刺激能力。在动物实验中也发现，GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 可产生保护性抗肿瘤免疫反应，而 GM-CSF 单独诱导的 BMDC 的保护性较弱，这些都说明 GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。 德国明斯特大学 (University of Munster) 的 Labeur 研究也表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成熟 DC，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导产生的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 BMDC 完全成熟。
因此笔者认为，要想获得功能更好的 BMDC，最好用 GM-CSF 和 IL-4 联合诱导骨髓细胞。而且，如果能在 Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中添加 IL-4，应该会获得更加成熟、有效的 BMDC。
3. 成熟诱导剂的选择
LPS，CD40L 和 TNF-α 无论对人 DC 还是小鼠 DC 均是常用、有效的成熟诱导剂，那么应该选择哪个呢？ TNF-a 诱导 DC 的成熟能力在三者中最弱 [7,8]。LPS 和 CD40L 均是 DC 体外完全成熟的强诱导剂，两者诱导 DC 的成熟度相似，但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L 诱导成熟的 BMDC 在体内显示出最强的免疫调节能力，包括保护性和治疗性肿瘤免疫反应的产生。 用 LPS 刺激 DC 完全成熟所用的浓度一般为 1-10μg/ml，但其实 0.1 μg/ml 已经有非常强的作用，但保险起见，一般选用 1μg/ml。 对于 CD40L 需要注意的是，CD40L 分子属于 TNF 配体家族，该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的 CD40L 三聚体蛋白来刺激 DC，这样会有很好的效果。如果用 CD40L 单体来刺激 DC，多数情况下成熟度并不是很高。
4. 培养方法的选择
【BMDC 相关试剂推荐】
注：用于 DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做 DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。
如对本文内容有所疑问，请查看原文地址 http://www.nbs-bio.com/xwzx_936.html 或联系欣博盛生物。
虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要，所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核细胞 (PBMC) 诱导 DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨髓来源的 DC (Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
【步骤简图】
本文主要介绍：
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法 (改良) 【BMDC 大量制备法】-Son 法 【BMDC 大量制备法】-Lutz 法 【注意事项】
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法 (改良)
背景：
1. Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106 个 / 小鼠； 2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体 + 补体法预先去除，后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高 BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做 [10]；
3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 1.1 小鼠 (6 - 10 周龄) 颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨 (femurs) 和胫骨 (tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净； 注：不要损伤到骨。 1.2 将骨移至超净台内，并用盛有 70% 酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次； 1.3 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至 骨完全变白； 1.4 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织； 1.5 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 1.6 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液 (1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min；
氯化铵红细胞裂解液的配制： 1. 先配制 10x 的贮存液，配法如下： 称取 82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3 和 0.37g Na2EDTA，溶于 1L 的蒸馏水中，0.22μm 滤膜过滤除菌，4oC 储存 6 个月； 注：可根据需要配制适量的 10x 贮存液，其中各组分需成比例增减。 2. 临用前，将 10x 贮存液用无菌蒸馏水 1 : 9 稀释成 1x 工作液即可。 注：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。 1.7 加入 10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后 1200 rpm 离心 5min，弃上清；1.8 PBS 洗 1 次，然后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。 2. BMDC 的诱导分化
2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 0.5-1 x 106/ml； 2.2 铺至 24 孔培养板内，每孔 1ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (20ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养，此为培养的第 0 天； 注：1) 一般一只小鼠大约可收获 4-5 x 107 个骨髓细胞，所以可以铺至少 40-50 个 24 孔板板孔。 2) GM-CSF 和 IL-4 的使用浓度区间分别为 20-50ng/ml 和 10-40ng/ml。 2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。 2.4 在第 5 天和第 8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞； 2.5 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 2.6 用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至 1 x 106/ml，并加入重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml)； 2.7 细胞铺板至 100 mm 培养皿 (每皿最多 10ml) 或 6 孔培养板 (2m / 孔)。 2.8 37℃，5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天； 2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的 BMDC。
3. BMDC 的完全成熟 注：步骤 2 中获得的 BMDC 并非完全成熟的 DC，若想得到完成成熟的 DC，还需 LPS，CD40L 或 TNF-a 等的诱导。 3.1 步骤 2.4 或 2.9 中获得的 BMDC 以 1200rpm 离心 5min，弃上清； 3.2 用含重组小鼠 GM-CSF (20 ng/ml) 和 IL-4 (10ng/ml) 的 RPMI 完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为 1 x 106/ml； 3.3 加入 24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如 TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或 CD40L (1μg/ml) 等； 3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天； 3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。
【BMDC 大量制备法】-Son 法
背景： 1. 该法可在 7 天内获得 30-40 x 106 个 DC / 小鼠，是 Inaba 经典方法的 7-10 倍。DC 经 14.5% 甲泛葡胺 (Metrizamide) 梯度离心后，纯度 (即 CD11c+/I-Ab + 细胞) 可达 85-95%。 2. 该法获得的 DC 的内吞能力弱于 Inaba 经典方法，但分泌的 IL-12p70 量相似； 3. 该法获得的 DC 在混合淋巴细胞反应中比 Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力； 4. 该法获得的 DC 能引起更强的特异性 T 细胞反应； 5. 以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的 BMDC。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法 (改良) 中的相应步骤。 2. BMDC 的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml； 2.2 铺至 6 孔培养板内，每孔 5ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养； 2.3 在培养的第 4 天，向培养体系中补充重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)； 2.4 培养的第 7 天收集 DC，用 2-4ml RPMI 1640 完全培养液重悬，加至等体积的 14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200 x g 室温离心 20min； 注：此时的 DC 为不完全成熟的 BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤 3。 2.5 收集中间层，并用 RPMI 1640 完全培养液洗 3 次备用。 3. BMDC 的完全成熟 3.1 步骤 2.4 中收集的 BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠 GM-CSF (1000U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml)，以及 LPS (1-10μg/ml) 3.2 37℃，5% CO2 培养箱培养 2 天，获得成熟的 BMDC。
【BMDC 大量制备法】-Lutz 法
背景：
1. Lutz 法与 Son 法相似，均可大量制备 BMDC，但与 Son 法相比，Lutz 法更为广泛地被采用。 2. 该法可获得更多的 BMDC，达 1-3 x 108 个 / 小鼠，而且纯度可达 90-95%； 3. 该法比 Son 法使用的细胞因子浓度低得多，仅为 200U/ml，而且培养的第 8 天到第 10 天降为 30-100U/ml，这样可以大幅节约试剂成本； 4. 该法与 Inaba 经典方法和 Son 法的最大不同是使用细菌培养皿 (Petri dish) 而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对 DC 成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。 5. 但该法的培养时间较长，需要 10-12 天，一方面是为了获得更多的 BMDC，另一方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的 BMDC 的纯度； 6. 该法仅用 GM-CSF 进行诱导培养，得到的 BMDC 中未成熟和成熟 DC 均有，若要进一步提高成熟度，需用 LPS 或 TNF-α 再诱导 1-2 天，其中成熟 DC 细胞的含量将达到 50-70%。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得 见 Inaba 法 (改良) 中的相应步骤，注意省去溶血步骤。
2. BMDC 的大量制备 2.1 步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml； 2.2 铺至 100mm 细菌培养皿 (Petri Dish) 中，每皿 10ml 细胞，同时加入重组小鼠 GM-CSF (200U/ml，对于 PeproTech 的 GM-CSF，相当于 20ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养； 注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。 2.3 第 3 天时，向培养皿中再加入 10ml 含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液； 2.4 第 6 天和第 8 天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿； 2.5 第 10 天时可收集细胞，即为 BMDC。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 培养第 10 天的 DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300 x g 室温离心 5min；
3.2 弃上清，用 10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀，然后铺于 100 mm 细胞培养板；
3.3 加入重组小鼠 GM-CSF (100U/ml ， 相当于 PeproTech 的 10ng/ml) 和 TNF-α (500U/ml)，或重组小鼠 GM-CSF (100U/ml，相当于 PeproTech 的 10ng/ml) 和 LPS (1μg/ml)； 3.4 37℃，5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天。
【BMDC 的鉴定】
1. 形态学观察：BMDC 多数呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的 BMDC 更加明显； 2. 细胞表型分析：流式细胞术检测 DC 细胞表面 CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 类分子 (I-A/I-E) 等的表达，BMDC 高表达这些分子，完全成熟的 BMDC 中这些分子的表达会进一步提高。 3. 混合淋巴细胞反应 (MLR)：BMDC 具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
【注意事项】
1. 小鼠品系和性别： 多数研究表明，所使用的小鼠品系与获得 BMDC 的数量和成熟度关系不大，但也有研究表明 C57BL/6 小鼠可能更好。 Lutz 表示从 C57BL/10，DBA/2，C3H/J 和 129 等小鼠品系均可获得足够数量和纯度的 BMDC，但 Lutz 在其实验中更倾向于使用 C57BL/6，ICR 和 BALB/c 小鼠，且发现 C57BL/6 小鼠的 BMDC 产量最高，而且 ICR 小鼠和 C57BL/6 小鼠的 BMDC 对 LPS 的成熟诱导敏感度高于 BALB/c 小鼠。 关于小鼠的性别，Inaba 认为雄性小鼠更好些，因为他们的骨骼更大，从而可以获得更多的前体细胞，但多数学者更倾向于使用雌性小鼠。因此，目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。
2. 单独使用 GM-CSF 还是联合使用 IL-4? Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中均仅用 GM-CSF 即可诱导出相当数量的 BMDC，而且也在混合淋巴细胞反应中表现出较强的刺激作用，但其实这些 BMDC 的成熟度并不足够高。 研究显示，GM-CSF+IL-4 联合诱导比 GM-CSF 单独诱导产生的 BMDC 表达更高的 MHC II 类分子和共刺激分子 CD80 和 CD86 等，提示前者具有更强的抗原递呈能力，而且前者在混合淋巴细胞反应中表现出更有效的刺激能力。在动物实验中也发现，GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 可产生保护性抗肿瘤免疫反应，而 GM-CSF 单独诱导的 BMDC 的保护性较弱，这些都说明 GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。 德国明斯特大学 (University of Munster) 的 Labeur 研究也表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成熟 DC，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导产生的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 BMDC 完全成熟。
因此笔者认为，要想获得功能更好的 BMDC，最好用 GM-CSF 和 IL-4 联合诱导骨髓细胞。而且，如果能在 Inaba 经典法和 Lutz 大量制备法中添加 IL-4，应该会获得更加成熟、有效的 BMDC。
3. 成熟诱导剂的选择
LPS，CD40L 和 TNF-α 无论对人 DC 还是小鼠 DC 均是常用、有效的成熟诱导剂，那么应该选择哪个呢？ TNF-a 诱导 DC 的成熟能力在三者中最弱 [7,8]。LPS 和 CD40L 均是 DC 体外完全成熟的强诱导剂，两者诱导 DC 的成熟度相似，但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L 诱导成熟的 BMDC 在体内显示出最强的免疫调节能力，包括保护性和治疗性肿瘤免疫反应的产生。 用 LPS 刺激 DC 完全成熟所用的浓度一般为 1-10μg/ml，但其实 0.1 μg/ml 已经有非常强的作用，但保险起见，一般选用 1μg/ml。 对于 CD40L 需要注意的是，CD40L 分子属于 TNF 配体家族，该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的 CD40L 三聚体蛋白来刺激 DC，这样会有很好的效果。如果用 CD40L 单体来刺激 DC，多数情况下成熟度并不是很高。
4. 培养方法的选择
【BMDC 相关试剂推荐】
注：用于 DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做 DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。
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